4mL DNA 離心超濾管 （30-50 KD）操作步驟

4mL DNA 離心超濾管 （30-50 KD）操作步驟

切取含有目的DNA 片段的瓊脂糖凝膠條帶。

   ● 盡量切除不含有目的DNA 部分的凝膠，減少凝膠體積，提高DNA 回收率。

   ● 切膠時，請使用長波長UV  （360 nm ）光盒。且不要將DNA 長時間暴露在紫外燈下，以防DNA 損傷。

2  稱取凝膠的重量近似地確定其體積。

   ● 凝膠重量的稱量方法：取.5 ml 離心管電子天平稱初質量，切膠裝在離心管后稱終質量，兩者差即為膠的質量。不同離心管的重量可能有差異，因此，每個離心管的重量需單獨稱量。

3  按照每00 mg 瓊脂糖凝膠對應00 µl 溶液BD 的比例，向離心管中加入溶液BD。

4  50 ℃水浴7-0min，直至凝膠*溶化。期間需要振蕩混合3 次。

   ● 瓊脂糖必須*融化，以免堵塞柱子，嚴重影響DNA 段的回收效率。

   ● 如果總體積大于500 µl，可適當增加溶膠時間。

   ● 若此時溶液變紅，可加0 µl 3M NaAC  （pH 5.2）。

5  將步驟4 所獲溶液置于DNA 純化柱中，靜置2min 。

   ● 膠塊*溶解后將膠溶液溫度降至室溫再上柱，因為純化柱在較高溫度時結合DNA  的能力較弱。

6  2,000 rpm 離心min。若溶液量大于DNA 純化柱的容積，可分兩次離心，棄濾液。

   ● 此時DNA 被吸附于DNA 純化柱中的硅膠膜上。

7  加入500 µl 溶液BD。2,000 rpm,  離心min，棄濾液

8  加入500 µl 溶液PE。2,000 rpm,  離心min，棄濾液。

   ● 溶液PE 初次使用前用無水乙醇按: 4 稀釋，即含80% 乙醇。

   ● 此步驟的作用是將硅膠膜上吸附的蛋白、鹽等雜質洗脫，以獲得高質量DNA 段。

9  加入500 µl 溶液PE。2,000 rpm,  離心min，棄濾液。

0 2,000 rpm 離心  3min ，以*去除純化柱中的液體。

   ● 此步驟的作用是去除殘留乙醇，避免殘留乙醇影響后續酶促反應。同時也利于DNA 段的充分溶解。

  將離心柱置于新的.5 ml 離心管中。向純化柱的處，懸空滴加30-00 µl 溶液Eluent  （60℃預熱），靜置2min 。2,000 rpm  離心min，管底即為目的DNA 段。貯存于-20℃。

   ● 溶液Eluent 可用無菌雙蒸水代替，但其pH 需為8.0-8.5，加入體積視DNA 目的段的多少、用戶對目的濃度要求而定。

   ● 對溶液Eluent 60℃預熱，會提高提取DNA 目的段的產量。

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