熒光RT-PCR試劑盒原理是:提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于:分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。
熒光RT-PCR試劑盒注意事項(xiàng)：
1.在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂。
2.為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對(duì)照。
3.內(nèi)參的設(shè)定:主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動(dòng)蛋白)等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。
4.PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長度、序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來確定。
5.防止DNA的污染:
(1)采用DNA酶處理RNA樣品。
(2)在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。
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