倍贊氏金蠅PCR檢測試劑盒說明書

注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時間；4．循環次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術的基本原理；7．PCR的反應動力學；8．PCR擴增產物；9．PCR反應體系與反應條件。

原理是由一對引物介導，能在動植物體外對特定基因(DNA)片斷進行快速酶促擴增，經過n個熱循環擴增，擴增產物中所含特定基因數是原始模板數的(1+E)n(0＜E＜1,擴增效率＝倍，使得檢測擴增產物中的特定基因成為可能。
 特異性強
PCR反應的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；
?
實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

蘇云金芽孢桿菌 Bacillus thuringiensis木耳 Auricularia auricula

麥迪、麥白霉素檢定培養基/Medecamycin Medium250克國產/進口

人胚腎細胞英文名稱：AAV-293

釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae熱帶假絲酵母 Candida tropicalis

M-TGE肉湯/M-TGE Broth奶制品中濾膜細菌計數250克國產/進口

人腺成纖維細胞*培養基100mL

泡盛曲霉 Aspergillus awamori克魯斯假絲酵母 Candida krusei

PC-3M-2B4(人前列腺低轉移細胞株)5×106cells/瓶×2

HEL(人紅白細胞白血病細胞)5×106cells/瓶×2

Caki-1, 人腎透細胞皮膚轉移細胞SiHa(人頸鱗細胞)

MPC-11(小鼠漿細胞瘤)5×106cells/瓶×2gersion

倍贊氏金蠅PCR檢測試劑盒說明書人關節軟骨細胞*培養基100mL

YT肉湯/YT BrothBR250克國產/進口

豌豆瘤菌 Rhizobium leguminosarum釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

RIN-m5f(大鼠胰島β細胞瘤細胞)5×106cells/瓶×2

小鼠腸靜脈內皮細胞*培養基SW-13(人腎上腺皮質細胞)

NCI-H1975(人肺腺細胞)5×106cells/瓶×2

小鼠膀胱平滑肌細胞*培養基豇豆慢生瘤菌 Bradyrhizobium vigna

凝結芽孢桿菌 Bacillus coagulans虎皮香菇，漏斗香菇 Lentinus tigrinus

改良Frey氏培養基基礎/Frey Medium Modified Base250克國產/進口

苜蓿中華瘤菌 Sinorhizobium meliloti宇佐美曲霉 Aspergillus usamii

鈉血瓊脂基礎/Sodium Chloride Blood Agar Base副溶血性弧菌的溶血試驗250克國產/進口

技術原理：
 DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。
       在聚合酶鏈式反應實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，并設計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。（ DNA高溫變性低溫復性）
       發現耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，并逐步應用于臨床。